Kromatografi, jenis-jenis dan cara kerja kromatografi

Kromatografi menurut Keulmans pada tahun 1959 adalah teknik pemisahan campuran secara fisika didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut di antara dua fase, fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas). Dari pengertian tersebut dapat diketahui bahwa terdapat dua komponen penting dalam kromatografi, yang fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas).

Definisi kromatografi menurut IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa padatan atau cairan yang dilapiskan pada padatan atau gel.

Bila fasa diam berupa zat padat aktif, maka kromatografi ini dikenal dengan kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fasa diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi partisi atau kromatografi pembagian (partition chromatography).

Suatu campuran pewarna dapat dipisahkan dengan teknik kromatografi karena adanya perbedaan kelarutan antara zat penyusun campuran pewarna tersebut. Selain itu, kecepatan bergerak partikel penyusun sangat dipengaruhi oleh ukuran partikel penyusunnya. Senyawa yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dari pada senyawa dengan ukuran lebih besar. Misalnya, tinta hitam merupakan campuran beberapa warna. Kita dapat memisahkan campuran warna tersebut dengan kromatografi sehingga kita dapat melihat komponen penyusun warna hitam tersebut.

Sejarah Kromatografi

Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh seorang ahli botani asal Rusia pada tahun 1906 yaitu Mikhail Semyonovich Tsvet (1901-1903). Tsvet pertama kali menemukan teknik kromatografi dalam penelitiannya untuk memisahkan klorofil dari pigmen-pigmen lain pada ekstrak tanaman.

Mikhail Semyonovich Tsvet, penemu teknik pemisahan kromatografi

Pada penelitian tersebut, Tsvet menggunakan sebuah kolom gelas yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat untuk memisahkan pigmen tanaman. Bubuk kalsium karbonat ini berfungsi sebagai penyerap (adsorben), sehingga kolom tersebut dikenal dengan istilah kolom adsorben.

Metode ini kemudian diuraikan dalam sebuah pertemuan yaitu XI Congress of Naturalists and Doctors di St. Petersburg pada tanggal 30 Desember 1901, sedangkan terbitan pertama yang berisi tentang deskripsi metode ini dipublikasikan di dalam Proceedings of the Warsaw Society of Naturalists, section of biology tahun 1903. Tsvet pertama kali menggunakan istilah kromatografi dalam 2 papernya tentang klorofil dalam jurnal botanical German, Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft pada tahun 1906.

Konstruksi kromatografi sederhana yang dilakukan oleh Tsevet

Pada awal perkembangannya, metoda kromatografi berkembang sangat lambat selama dua puluh tahun pertama. Pada tahun 1948 A. Tiselius dari Swedia mendapatkan hadiah nobel dalam bidang kromatografi yaitu analisis dengan elektroforesis dan adsorpsi. Setelah metoda kromatografi partisi diperkenalkan pada tahun 1952, metoda kromatografi menjadi suatu metoda yang sangat universal.

Metoda kromatografi banyak digunakan dalam bidang biokimia, kimia organik maupun kimia anorganik, kimia analisa, kimia bahan pangan dan bidang lainnya. Pada perkembangan selanjutnya, kromatografi telah dilengkapi dengan perangkat canggih seperti komputer dan alat bantu lain sehingga memperluas pemanfaatannya dalam berbagai disiplin ilmu yang lain. Kromatografi terus berkembang dengan lahirnya berbagai jenis kromatografi antara lain kromatografi gas-spektrometri massa (GC-MS), kromatografi cair tekanan tinggi (HPLC) serta kromatografi ion.

Prinsip Kerja Kromatografi

Kromatografi bekerja dengan prinsip dasr yaitu jumlah zat terlarut yang berbeda untuk masing-masing komponen pada waktu tertentu saat kesetimbangan terjadi antara fase diam dan fase geraknya. Pemisahan dengan metode kromatografi dapat terjadi apabila suatu molekul maupun senyawa memiliki sifat yang berbeda, di antaranya adalah:

Memiliki kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut.
Memiliki sifat kelarutan atau sifat untuk berikatan yang berbeda satu sama lain dengan fase diamnya.
Memiliki sifat mudah menguap (volatil) pada temperatur yang berbeda.

Berikut ini penjelasan singkat mengenai pemisahan senyawa pada kromatografi. Pemisahan secara kromatografi, senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan pada sistem tertentu (seperti: kolom) di mana dalam sistem tersebut terdapat bagian yang diam atau stasioner (biasanya berupa padatan atau cairan yang dideposisikan pada padatan) yang disebut sebagai fasa diam dan kemudian dibawa atau mengalir melalui suatu bagian mobile atau yang diketauhi sebagai fase gerak, dimana selama proses pengaliran tersebut akan terjadi interaksi antara komponen senyawa dengan fase diamnya. Selama berinteraksi akan terjadi proses pelarutan, adsorpsi maupun penguapan dari komponen senyawa yang akan dipisahkan.

Sifat-sifat dari komponen penyusun senyawa tersebut akan menentukan apakah komponen-komponen tersebut mampu bergerak bebas (berinteraksi lemah) atau berinteraksi kuat dalam fase diamnya. Bila semua komponen-komponen yang ada tidak dapat bergerak dalam fase diam, maka proses pemisahan tidak mungkin dapat berlangsung. Apabila dapat bergerak, pemisahan akan bergantung pada sejauh mana kecepatan bergerak di antara komponen-komponen tersebut maupun perbedaan kecepatannya dengan kecepatan fasa gerak yang dipakai pada sistem tersebut.

Oleh karena itu pada metoda kromatografi perlu dilakukan pemilihan fase gerak sedemikian rupa sehingga semua komponen dapat bergerak dengan kecepatan yang berbeda-beda sehingga proses pemisahan dapat terjadi. Secara umum dapat dikatakan bahwa kromatografi adalah proses migrasi diferensial dimana komponen-komponen sampel ditahan secara selektif oleh fase diam.

Gambar berikut merupakan ilustrasi pemisahan menggunakan metode kromatografi kolom.

Gambar berikut merupakan ilustrasi pemisahan menggunakan metode kromatografi kolom.

Pemisahan komponen A dan B pada kolom kromatografi

Kromatogram Pemisahan Senyawa A dan B

Pada gambar tersebut, sampel berada dalam fasa gerak (eluen) dimasukkan ke dalam kolom pemisahan. Komponen dalam sampel akan mulai terpisah sesaat setelah berada dalam kolom. Setelah berinteraksi dengan fase diam kolom, eluen dan komponen senyawa akan keluar dari kolom melalui detektor untuk selanjutnya dianalisis secara kuantitatif.

Teori pemisahan pada kromatografi

Ada dua pendekatan yang digunakan untuk menjelaskan tentang proses pemisahan yang digunakan dalam metode kromatografi, yaitu plate theory dan rate theory.

1. Plate Theory,

dikenalkan pertama kali oleh Martin dan Synge pada tahun 1941. Teori ini didasarkan pada analogi dengan proses distilasi dan ekstraksi. Plate Theory mengasumsikan bahwa pada kromatografi kolom terdapat sejumlah lapisan-lapisan pemisah yang dikenal sebagai theoretical plates. Pemisahan sampel antara fasa diam dan gerak terjadi pada “plates” tersebut. Analit bergerak sepanjang kolom melalui transfer keseimbangan fasa gerak dari satu plate ke plate selanjutnya.

Teori Plate

Dalam plate theory, kita mengasumsikan bahwa kolom kromatografi merupakan sebuah sistem tetap dalam kesetimbangan. Masing-masing spesies menunjukkan sistem keseimbangan antara fasa diam dan fasa geraknya.

2. Rate Theory,

dikenalkan oleh J.J. van Deemter pada tahun 1956 dimana proses pemisahan didasarkan pada jumlah pemisahan pada kondisi dinamisnya. Proses yang terjadi dalam kolom membutuhkan waktu tertentu untuk zat terlarut mencapai keseimbangan dengan fase diam dan fase geraknya. Hasil analisis kromatogram berupa puncak-puncak kromatografi yang dipengaruhi oleh laju elusinya. Bentuk atau karakter pelebaran puncak kromatogram disebabkan oleh 3 faktor yaitu difusi eddy, difusi longitudinal dan transfer masa.

a. Diffusi Eddy

Difusi Edi disebabkan karena ketidakseragaman packing pada kromatografi kolom, meliputi perbedaan bentuk, ukuran partikel-partikel pengisi kolom, cara pengisian kolom, dan diameter dari kolom Perbedaan ini mengakibatkan solut akan mengambil jalan yang berbeda untuk melalui kolom sehingga terjadi perbedaan waktu keluarnya molekul-molekul dari kolom. Perbedaan tersebut menyebabkan pelebaran puncak dari solut. Untuk memperkecil efek ini, digunakan partikel-partikel kecil dengan ukuran sama tetapi tidak menyebabkan penurunan tekanan yang terlalu tinggi dalam kolom, diameter kolom yang kecil, pengepakan yang mampat dan ukuran sama tanpa memecahkan partikel-partikel pengisi kolom tersebut.

Pelebaran puncak akibat distribusi Eddy

b. Difusi Longitudinal

Difusi Longituidinal disebabkan karena kecenderungan zat terlarut untuk berdifusi. Molekul-molekul zat terlarut cenderung untuk berdifusi dari daerah yang konsentrasinya tinggi ke daerah dengan konsentrasi rendah. Akibatnya, waktu melintasi kolom, molekul-molekul akan menyebar (berdifusi) ke belakang dan ke depan. Derajat pelebaran puncak pada longitudinal diffusion dipengaruhi oleh proses difusi solut dan Laju alir solut selama melewati kolom.

Difusi Longitudinal

c. Transfer Massa

Transfer massa untuk pemisahan zat terlarut pada fase diam, tidak terjadi begitu saja melainkan bergantung pada partisi zat terlarut dan koefisien difusinya.

Yang pertama transfer massa fase gerak. Solut yang tidak bergerak melalui kolom ketika berada pada fase gerak dalam kondisi stagnant akan membutuhkan waktu lebih lama di dalam kolom daripada solut yang melewati kolom begitu saja bersama fase geraknya. Transfer massa fase gerak dapat menyebabkan pelebaran puncak kromatogram karena perbedaan profil alir pada kanal atau diantara partikel pendukung pada kolom. Solut yang melalui bagian tengah kanal akan lebih dahulu mencapai ujung kolom daripada solut yang melalui bagian tepi kanal. Derajat pelebaran puncak yang dipengaruhi oleh difusi Eddy dan transfer massa fase gerak dikarenakan ukuran dari packing materialnya dan laju difusi solut.

Difusi transfer massa fasa gerak

Yang kedua adalah Transfer massa fase gerak tetap (stagnant). Transfer massa fase gerak stagnant menyebabkan pelebaran puncak karena perbedaan laju difusi dari molekul solut antara fase gerak diluar pori pada fase diam (flowing mobile phase) dengan fase gerak didalam pori (stagnant) pada fase diamnya (stagnant mobile phase). Derajat pelebaran puncak sangat dipengaruhi oleh beberapa hal yaitu ukuran, bentuk dan struktur pori dari packing material, difusi dan retensi dari solute, serta laju alir solut ketika melalui kolom.

Difusi transder massa fasa gerak tetap

Jenis-jenis kromatografi

Jenis-jenis kromatografi dapat diklasifikasikan antara lain berdasarkan jenis fase (baik fasa diam maupun bergerak) yang digunakan, sistem geometri dan prinsip pemisahannya. Perhatikan tabel di bawah ini, tabel penggolongan kromatografi.

1. Kromatografi berdasarkan fasa yang terlibat

Pemisahan tipe kromatografi berdasarkan fase yang terlibat ditunjukkan pada tabel berikut :

2. Kromatografi berdasarkan sistem geometri

Klasifikasi jenis kromatografi berdasarkan sistem geometrinya dapat dibagi menjadi kromatografi kolom dan kromatografi planar.

a. Kromatografi kolom

Kromatografi kolom, fase diamnya terdeposisi pada pipa yang berbentuk kolom. Pada kromatografi kolom, komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak melalui kolom tersebut dan kemudian setiap komponen akan terpisahkan.

Kromatografi gas menggunakan kolom sebagai pemisah

Setiap komponen yang keluar dari kolom akan masuk ke detektor untuk dianalisis. Hasilnya disajikan dalam bentuk puncak-puncak (peaks) kromatogram yang mengidentifikasikan konsentrasi eluen sebagai fungsi waktu. Luasan puncak sebanding dengan konsentrasi komponen sampel.

Kolom Kapiler Kromatografi

b. Kromatografi planar

Kromatografi Planar (Kromatografi lapis tipis) merupakan jenis kromatografi di mana fase diamnya berupa film tipis dengan partikel padat yang terikat bersama melalui kekuatan mekanik pada senyawa pengikat seperti kalsium sulfat.

Kromatografi planar – kromatografi lapis tipis

Pada kromatografi lapis tipis ini komponen yang akan dipisahkan bergerak bersama fase gerak dalam sebuah bidang datar. Senyawa yang bergerak terlihat seperti noda (spot) yang dapat dikenali. Posisi noda menunjukkan identitas suatu komponen/senyawa, sedangkan besar atau intensitas noda menunjukkan konsentrasinya.

Pada kromatografi planar ini beberapa bercak komponen/senyawa dapat dipisahkan langsung secara bersamaan maupun dipisahkan dengan beberapa langkah, dimana langkah yang selanjutnya tegak lurus arahnya dengan langkah yang pertama. Cara ini dikenal dengan metode kromatografi dua dimensi. Gambar dibawah ini menunjukkan proses pemisahan menggunakan metode kromatografi planar.

3. Kromatografi berdasarkan prinsip pemisahan

Klasifikasi jenis kromatografi berdasarkan prinsip pemisahannya dapat dibagi menjadi Kromatografi Adsorpsi, Kromatografi Partisi, Kromatografi Pertukaran ion, Exclusion Chromatography dan Affinity Chromatography.

a.Kromatografi Adsorpsi

Pada jenis kromatografi adsorpsi, prinsip pemisahan berdasarkan proses adsorpsi analit dalam permukaan padatan fase diam. Padatan fase diam dapat berupa silika gel atau alumina yang memiliki luas permukaan relatif besar. Kromatografi adsorpsi merupakan salah satu metode kromatografi yang cukup lama. Pemisahan didasarkan pada perbedaan sifat afinitas adsorpsi dari komponen sampel pada permukaan padatan aktif. Kromatografi adsorpsi menggunakan fase gerak cairan maupun padatan yang mampu teradsorp pada permukaan fase diamnya. Pada gambar dibawah ini ditunjukkan interaksi adsorpsi antara analit pada fase gerak dengan permukaan fase diamnya.

Kromatografi adsorpsi

Metode kromatografi adsorpsi memiliki beberapa kelemahan dia antaranya yang pertama adalah keterbatasan jumlah adsorben yang dapat digunakan untuk melakukan pemisahan. Kedua adalah koefisien distribusi terhadap adsorpsi yang seringkali tergantung pada konsentrasi total komponen yang akan dipisahkan, sehingga mengakibatkan pemisahan kurang sempurna.

b. Kromatografi Partisi

Kromatografi partisi adalah kromatografi dimana proses pemisahannya berdasakan kemampuan adsorpsi analit pada lapisan tipis cairan yang dilapiskan pada partikel padatan inert fase diamnya. Prinsip utama pemisahan berdasarkan perbedaan kelarutan antara komponen sampel pada fase diamnya (gas chromatography), atau berdasarkan perbedaan kelarutan komponen dalam fase gerak dengan fase diamnya (liquid chromatography). Keuntungan metode kromatografi partisi ini adalah distribusinya tidak bergantung pada konsentrasi, sehingga pemisahan dapat terjadi lebih baik.

Kromatografi partisi

c. Kromatografi Pertukaran ion

Pada kromatografi penukar ion, ion terpisahkan berdasarkan gaya elektrostatiknya membentuk grup fungsional yang bermuatan pada fase diam. Kromatografi penukar ion menggunakan resin sebagai padatan fase diam yang berguna untuk mengikat anion atau kation. Larutan ion bermuatan pada fase gerak akan berikatan denga resin yang memiliki muatan berlawanan melalui gaya elektrostatik.

Kromatografi penukar ion

d. Exclusion Chromatography

Exclusion Chromatography merupakan tipe kromatografi yang tidak banyak dipengaruhi oleh interaksi antara fase diam dengan zat terlarutnya. Proses pemisahan berdasarkan volume hidrodinamik dari molekul atau partikel. Dalam teknik ini, gel nonionik dengan ukuran pori yang sama digunakan untuk memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM).

Kromatografi eksklusi

Molekul-molekul yang kecil akan memasuki pori-pori dari gel sedangkan molekul besar akan melewati sela-sela gel lebih cepat bila dibandingkan dengan molekul yang melewati pori-porinya. Jadi urutan elusi mula-mula adalah molekul yang lebih besar, molekul sedang, dan terakhir molekul yang paling kecil. Apabila fasa diamnya adalah gel yang hidrofil maka teknik ini disebut gel filtration chromatography dan bila digunakan gel yang hidrofob (polystyrene-divinylbenzene) disebut gel permeation chromatography.

e. Affinity Chromatography

Kromatografi afinitas bekerja berdasarkan pada interaksi spesifik antara satu jenis molekul zat terlarut dengan jenis molekul lain yang terimmobilisasi dalam fase diam. Sebagai contoh, molekul yang terimmobilisasi dapat menjadi antibodi untuk beberapa protein yang spesifik. Saat zat terlarut yang mengandung campuran protein melewati molekul ini, hanya protein tertentu saja yang akan bereaksi dengan antibodi yang terimmobilisasi pada fase diam.